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His标签蛋白纯化树脂(Hisar Ni-NTA Agarose Resin)以交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体，螯合镍离子(Ni²⁺)后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，与Ni-IDA树脂相比，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可或缺的树脂之一。

• 缓冲液的准备
  缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer在使用前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。
  
• 样品准备
  
  • 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)
    
    • 挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
      
    • 表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM)，同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
      
    • 之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/mL。
      注：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
      
    • 将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高，可考虑加入10μg/mL RNase A和5μg/mL DNase I)，混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
      
    • 收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃离心20～30min。取上清0.22μm或0.45μm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。
  • 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
    将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
    注：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
    
  • 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
    
    • 将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
      
    • 按照菌体：裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
      
    • 将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20～30min，去上清。可重复步骤b和c一次。
      
    • 按照菌体：裂解液(含8M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
      
    • 变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
• 样品纯化
  
  • 装柱：将Hisar Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。
    
  • 清洗：3～5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。
    
  • 平衡：至少5倍柱体积的Lysis Buffer平衡色谱柱。
    
  • 上样：注意控制加样速度，确保目的蛋白与Ni2+充分接触，以提高纯化得率。
    注：注意收集流出液，用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。
    
  • 平衡/洗杂：Wash Buffer平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10～15个柱体积)。注意收集流出液。
    注：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
    
  • 洗脱：使用5～10倍柱体积Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即目的蛋白溶液。
    
  • 清洗：依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。
    注：建议在清洗之前用更高浓度咪唑(如500mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。
    
  • 保存：5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。
• SDS-PAGE检测
  将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

• 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
  使用30%异丙醇清洗5～10个柱体积，接触时间为15～20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1～0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。
  
• 去除离子作用结合的蛋白
  使用1.5M NaCl溶液接触10～15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

• 使用5倍柱体积去离子水清洗填料；
  
• 使用5倍柱体积100mM EDTA(pH8.0)剥落镍离子；
  
• 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
  
• 使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积，停留10～15min；
  
• 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
  
• 使用3～5倍柱体积100mM NiSO4再生挂镍；
  
• 去离子水清洗10倍柱体积。
  
• 填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。